北京化工大学考研(北京化工大学考研难度)
北京化工大学考研，北京化工大学考研难度
在上个世纪，由于抗生素进入临床实践，全球死亡率显著下降。不幸的是，抗生素滥用加剧了耐多药（MDR）细菌的传播。根据2017年世界卫生组织重点病原体清单，耐多药鲍曼不动杆菌（AB）细胞（MDR-AB）已被列为“优先级1类关键”病原体，由这些细胞所引起的肺炎极其危险且可能致命。目前，新抗生素的开发周期无法与正在发生的耐多药感染危机相匹配。因此，需要新的策略来使耐多药细菌对现有抗生素重新敏感。
日前，北京化工大学徐福建教授、秦蒙副教授和俞丙然教授合作利用二硫化物交换聚合法合成了一种新型阳离子多糖缀合物Dex-g-PSSn。其中，亚抑制浓度的Dex-g-PSS30可以破坏细菌膜和外排泵，从而增强了细菌内利福平（RIF）的积累并恢复其功效（图1）。Dex-g-PSS30和RIF的结合可防止培养超过30代的细菌产生耐药性。此外，Dex-g-PSS30在肺炎诱导的小鼠模型中恢复了RIF的有效性，减少了炎症反应，并表现出优异的体内生物吸收和降解能力。因此，作为一种抗生素佐剂，Dex-g-PSS30为RIF 针对MDR细菌和细菌耐药性提供了一种新的再敏化策略。该工作以“Cationic Polysaccharide Conjugates as Antibiotic Adjuvants Resensitize Multidrug-Resistant Bacteria and Prevent Resistance”发表在《Advanced Materials》。
图1. 阳离子多糖缀合物Dex-g-PSSn作为抗生素佐剂示意图及细菌耐药的相关预防机制。
Dex-g-PSSn作为抗生素佐剂疗效
MDR-AB细胞可以被1/4最小抑菌浓度（MIC）的Dex-g-PSS30和1/4 MIC RIF所抑制（图2a）。此外，杀菌动力学测定（图2b）显示，1/4 MIC Dex-g-PSS30和1/4 MIC RIF的组合在3小时内可以迅速杀死MDR-AB 细胞。然而，单独使用1/4 MIC Dex-g-PSS30或1/4 MIC RIF对MDR-AB 细胞生长无效。使用SEM检查MDR-AB细胞形态（图2c）；未经处理的MDR-AB 细胞表现出正常的椭圆形形态，具有光滑的表面和完整的细胞壁。而单独用1/4 MIC Dex-g-PSS30或1/4 MIC RIF处理的MDR-AB细胞也观察到了类似的结果。 然而，细菌膜在1/4 MIC Dex-g-PSS30和1/4 MIC RIF的组合存在下收缩和破裂，这表明细菌死亡。
图2. Dex-g-PSSn作为抗生素佐剂疗效和抗生素再敏化机制
抗生素再敏化机制
研究者利用荧光强度分析Dex-g-PSS30对细菌外膜通透性的影响（图2d）。 Dex-g-PSS30以剂量依赖性方式增强外膜通透性，表明Dex-g-PSS30干扰膜并增加其通透性。接下来，研究者研究Dex-g-PSS30对细胞内膜的影响（图2e），内膜以剂量依赖性方式被破坏。此外，荧光强度随着相互作用时间逐渐增加，表明Dex-g-PSS30对内膜的破坏作用增强。研究者进一步研究Dex-g-PSS30对细胞质膜去极化的影响发现，未加入Dex-g-PSS30时，荧光较弱，而加入Dex-g-PSS30后荧光迅速增加，呈剂量依赖性，Dex-g-PSS30影响细胞膜电位(Δ)。在8 μg/mL浓度下，Dex-g-PSS30对细菌膜电位有显著影响（图2f）。
由于外排泵功能可能与膜电位直接相关，因此研究者研究了Dex-g-PSS30对外排泵的影响（图2g）。Dex-g-PSS30显著影响了外排泵的功能，随着Dex-g-PSS30浓度的增加效果更加明显。此外，Dex-g-PSS30会产生活性氧（ROS）积累，并导致额外的膜损伤和破坏细菌稳态（图2h）。最后，研究者利用高效液相色谱法用于检查细菌内的RIF浓度（图2i）。与未添加Dex-g-PSS30相比，添加Dex-g-PSS30大大提高了RIF在 MDR-AB细胞中的积累，因此恢复了RIF功效。
图3. Dex-g-PSS30防止细菌耐药性
Dex-g-PSS30可防止细菌耐药性
尽管Dex-g-PSS30和RIF联合治疗使MDR细菌重新敏感，但问题仍然存在，如果继续使用抗生素和Dex-g-PSS30是否会导致新的耐药性。因此，在存在或不存在Dex-g-PSS30的亚抑制浓度的情况下，用RIF培养细菌30天（图3a）。用RIF和1/4 MIC Dex-g-PSS30培养的MDR-AB细胞（30S）在30次传代后防止了细菌出现耐药性，重要的是，MIC没有变化。相比之下，仅用RIF培养30代的 MDR-AB细胞（30R）获得了强烈的耐药性，并显示MIC值增加了1024倍。
使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察RIF和细菌共定位（图3c）。在30S细胞中，观察到相当多的黄色荧光，表明细菌内部有高RIF积累。然而，在30R细胞中观察到低黄色荧光，表明RIF难以进入细胞。流式细胞仪还用于检查细菌内的RIF积累（图3d）；与30S细胞相比，30R细胞内的RIF水平要低得多。因此，30R细胞中的强耐药性与细菌内RIF积累不良有关。
图4. 基因转录分析
基因转录分析
使用Pearson相关系数评估三个样本组中的差异表达基因（DEG）(图4a)。30R细胞中的基因表达水平差异很大，这可能是它们对抗生素产生高度耐药性的原因。从DEG维恩图（图4b）中，30R细胞比MDR-AB和30S细胞表达更多的DEG。并且，与30S细胞相比，30R细胞中415个基因被下调，355个基因被上调（图4c）。此外，与 MDR-AB 细胞相比，438个基因在30R细胞中下调，492个上调（图4d）。然而，与 MDR-AB 细胞相比，30S 细胞中只有176个基因被下调，187个基因被上调（图4e）。因此，Dex-g-PSS30通过基因转录的差异改变防止了细菌耐药性。
Dex-g-PSS30的吸收分布
荧光成像被用于研究Dex-g-PSS30在体内的吸收和分布（图5a）。具体而言，将Cy5.5-Dex-g-PSS30雾化到小鼠肺中。研究者在特定时间测量了主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的体内荧光分布。最初，Cy5.5-Dex-g-PSS30仅分散在肺部，与气管内雾化方法一致。然后，荧光肺强度在接下来的72小时内逐渐降低，但在肝脏和肾脏中增加然后逐渐降低。因此，Cy5.5-Dex-g-PSS30通过肝脏和肾脏排泄，从而降低了Cy5.5-Dex-g-PSS30在体内的积累。从肝脏、肺和肾脏的定量荧光分析中得出了相同的结论（图5b）。研究者还连续测量了有或没有Dex-g-PSS30的肺中RIF浓度发现，Dex-g-PSS30从30分钟到72小时对RIF药代动力学没有显著影响（图5c）。
图5. Dex-g-PSS30的吸收分布和体内治疗
有效治疗体内诱发肺炎
研究者进一步在MDR-AB 诱导的肺炎小鼠模型中测试Dex-g-PSS30的治疗效果（图5d）。在 PBS 组中，在肺中观察到高细菌水平，而Dex-g-PSS30（单独）或RIF（单独）的水平略有下降。然而，Dex-g-PSS30+RIF处理的肺中几乎不存在细菌。因此，Dex-g-PSS30充当抗生素佐剂在体内使MDR-AB细胞对RIF重新敏感（图5e-f）。综上所述，通过联合治疗，抗生素佐剂Dex-g-PSS30在体内恢复了RIF的抗菌作用，并对肺炎诱导的小鼠模型产生有益的治疗作用。
小结：研究者使用二硫键交换聚合法成功合成了一种阳离子多糖缀合Dex-g-PSSn。结合不同的抗生素，Dex-g-PSS30使MDR细菌重新致敏并特异性预防细菌耐药性。亚抑制性Dex-g-PSS30浓度导致内外细菌膜受损，细胞内ROS水平增加，进一步引起细菌膜损伤并促进细胞内抗生素进入。此外，细菌外排泵受到Dex-g-PSS30的影响并减少了抗生素外排。最后，Dex-g-PSS30阻止了细菌耐药性，并在MDR-AB诱导的肺炎小鼠模型中恢复了RIF功效。总体而言，研究者提出了一个新的平台，用于使MDR细菌对抗生素重新敏感并预防细菌耐药性。
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原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202204065
来源：高分子科学前沿
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