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1916年12月26日，蔡元培出任北京大学校长。1916年至1927年，蔡元培担任北大校长的这十年，是北京大学校史上的一段辉煌期，“奠定了北大的传统和精神”。1917年1月9日，北京大学开学，蔡元培在开学典礼上发表演说，对学生提出三点要求：“抱定宗旨”、“砥砺德行”、“敬爱师友”。蔡元培主张“大学者，研究高深学问者也”，“循思想自由原则、取兼容并包之义”，对北京大学进行了一系列的改革。

他辞退了一批不称职的中国、外国教师。他聘请陈独秀、夏元瑮分别出任文科、理科学长，聘请胡适、李大钊、鲁迅、刘半农、梁漱溟、李四光、王星拱、颜任光、钟观光、任鸿隽、李书华、丁西林、马寅初、陶孟和、陈启修、王世杰等到校任教。此期间在北京大学任教的著名学者还有黄节、吴梅、刘文典、陈垣、马裕藻、沈兼士、朱希祖、马衡、康心孚等。对有学术造诣、政治上守旧的辜鸿铭、刘师培、黄侃等人，蔡元培也用其所长。

蔡元培仿效德国莱比锡大学的管理制度，在北京大学推行教授治校、民主管理的制度。他设立了评议会，将其作为学校最高权力机关和立法机关，评议员由教授选出。后来，又在各学门（系）设立教授会。教授会管理学门（系）内事务，有较大的自主权。教授会主任由教授互选。教授、讲师，中国教员和国外教员都是教授会的会员。随后又设立北京大学行政会议、教务会议、总务处。至1920年9月，北京大学教授治校的管理体制已经基本成熟。蔡元培倡导教育独立，认为官僚政客不应干涉教育，为此几次辞去北京大学校长职务。

蔡元培力图将北京大学办成以文、理两科为重点的综合性大学，将商科并入法科，把工科并入北洋大学。1919年，蔡元培撤销文、理、法科，学门不再隶属于科，并改学门为学系，设14个学系。蔡元培废除年级制，实施选科制，以发展学生个性，沟通文理。1917年，蔡元培在北京大学设立文、理、法三科研究所，培养研究生。这是中国高校最早的研究所。1918年，他创立《北京大学月报》，为中国最早的大学学报。蔡元培积极开展学术交流，邀请杜威、罗素、班乐卫、普朗克等名家到北大讲学。

蔡元培在北大推行旁听生制度，使北大的学术活动对社会开放。北大还创办平民学校，为一般民众提供教育。1920年，北京大学允许3名女生进入文科旁听，并在同年秋天正式开始招收女学生，开中国公立大学男女同校之先。蔡元培重视体育、首倡“美育”，设立音乐研究会（后来改名为音乐传习所）、画法研究会，聘请徐悲鸿、刘半农、陈石曾、萧友梅任教。他还支持学生社团活动，鼓励学术争鸣。1918年1月，蔡元培为整饬校风，设立了进德会。

1917年，陈独秀被聘为北京大学教授、文科学长，将他创办的《新青年》迁至北京。胡适、钱玄同、刘半农、李大钊、沈尹默、高一涵等北大文科教授参与《新青年》编辑，倡导民主与科学。胡适发表《文学改良刍议》，陈独秀作《文学革命论》，鲁迅写出《狂人日记》《孔乙己》《药》；陈独秀与李大钊创办《每周评论》，北大学生创办《新潮》《国民》等刊物，宣传新思想、新文化，使北京大学成为新文化运动的中心。

1919年，北洋政府密令中国外交代表团在巴黎和约上签字，将德国在山东的特权转交日本。消息传至北京，5月3日北京大学学生邀请北京12所大专学校代表在北大三院礼堂开会，大会决议将原定5月7日的国耻纪念日游行提前到5月4日。5月4日，北京大专院校三千余名学生聚集天安门游行示威，“五四运动”爆发。北京大学学生傅斯年任游行队伍总指挥。集会宣读了北大学生许德珩起草的《北京学生界宣言》，游行中散发了北大学生罗家伦起草的《北京学界全体宣言》。游行学生火烧赵家楼，痛打章宗祥。

随后，上海等城市出现工人罢工、商人罢市、学生罢课，北洋政府被迫罢免曹汝霖、陆宗舆、章宗祥的职务，并拒绝签署巴黎和约，学生运动取得胜利。五四运动后，北京大学教授李大钊率先在中国系统地接受、传播、实践马克思主义，北大成为中国研究与传播马克思主义的中心。1920年8月，陈独秀创建上海共产党小组。1920年10月，李大钊创立北京共产党小组。中共一大前，中国53名中共党员有21名是北大师生、校友。

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